Ingineria genetică - studopediya

Plan: de inginerie genetică.

Tehnologia hibridom pentru producerea de anticorpi monoclonali

Termenul „Biotehnologia“ a fost distribuit pe scară largă în cei 70 de ani ai acestui secol. Biotehnologia se bazează, pe de o parte, pe tradiția veche de fermentare și a industriilor de microbiologie cal, pe de altă parte - ultimele descoperiri ale biologi Stiinte fizice. Biotehnologie - știința utilizării organismelor vii și a proceselor biologice în producție. Acest com-plex multi-disciplinare științifică și tehnologică pro-Gressa inclusiv sinteza microbiană diversă, inginerie genetică și celulară, inginerie enzimolo-Gia. Biotehnologie apărut la intersecția dintre microbiologie, biochimie si biofizica, genetica si genetica moleculara, citologie si imunologie. nivelul de dezvoltare determină în mare măsură potențialul științific și tehnic al țării. Costul producției globale biotehnolo-cal până la sfârșitul secolului XX. experții estimează, va ajunge la 20 de miliarde de $. Progresul biotehnologiei în animale ducere în următorii 10-15 ani va fi determinată de dezvoltarea ingineriei genetice, celulare si embryogenetic.

Ingineria genetică - secțiunea biotehnologiei asociate cu scop-guvernare în construcția vitro a unor noi combinații de genetic-un material capabil de a reproduce într-o celulă și să sintetizeze TVA anumit produs.

Ingineria genetică are următoarele obiective:

1) obținerea genelor prin sinteză sau izolarea acestora de adeziv curent;

2) producerea de molecule de ADN recombinant;

3) Clonarea genelor sau structuri genetice;

4) introducerea într-o celulă de gene sau structuri genetice și proteine ​​străine-sin mes.

Prepararea genelor. Există două metode de artificiale sin-teză de gene in afara corpului - chimice și enzimatice. Hee-ică 1969 omul de știință american G. Koran și colab. alanină sintetizat gena ARNt de drojdie. Această genă a constat din 77 de perechi de nucleotide, secvența care a fost

Acesta a fost deja descifrat. Oamenii de știință sintetizat ADN frag-mente în lungime de la 5 la 12 nucleotide, și apoi le-a pus împreună într-o anumită ordine, prin intermediul timpului pentru a deschide o enzimă ligază. Cu toate acestea gena ARNt alanină atunci când este introdus într-o celulă de Escherichia coli sau acelulare mediu niroval nu funcțional. Sa dovedit că el nu avea elemente de reglementare - promotorul, în cazul în care punctul localizată de inițiere a sintezei și codonii termo-țional, care dau un semnal de terminarea sintezei ARNm In 1976, G. și colab Coranul. Am realizat sinteza supresoare tirozina genei ARNt de 126 bp lungime UNS-leotidov. Ei au fost, de asemenea, sintetizate gene adiacente la porțiunile regu-batery: promotor (52 de perechi de baze), iar termenul-pilier (pereche 21 nucleotidă) și atașat la capetele polimerului și tetranucleotide Aatt TTAA. In acest caz, o genă sintetizată artificial inserată în genomul fagului T4 mutant atunci când este introdus în coliforme viu avansat rabotospo, care sunt capabili. În 1979, în țara noastră, sub conducerea lui Yu Ov chinnikova și M. N. Kolosova chimic prin enzime sintetizate gene de hormoni umani și MS-votnyh - encefalină și bradikinina.

sinteză chimică enzimatică mai degrabă larg dizolvat în aplicarea ingineriei genetice pentru a produce gene mici. Pentru gene semi-cheniya de animale, plante si oameni, mărimea care este de 1000-3000 nucleotide lungime, această metodă este prea complicată și până în prezent nu este fezabilă. Oamenii de știință au descoperit o cale mai ușoară în radiații, astfel de gene.

In 1970 G. G. Temin și colab. enzima revers transcriptaza (revers transcriptaza). In 1972, sa descoperit ca secara nekoto virusurile oncogene folosind revers transcriptaza poate sintetiza ADN folosind mARN ca matriță. Analiza ulterioara a aratat ca matricea pentru copiile de imagine-Bani de ADN poate servi nu numai virusurile oncogene ARN, dar alte ARNm de. Este posibil, în principiu, sinteza enzimatică a oricăror gene individuale (ADN), folosind copiile ARN ale acestora. Sub sinteza enzimatică a transcripția genei medie-complementaritate, catenei ADN clorhidric (gena) molecule de ARN in vitro. Sistemul de sinteză este o soluție, care conține toate cele patru nucleotide care alcătuiesc ADN-ul, ioni de magneziu, enzima revers transcriptază (preparat din virusurile oncogene) și matricea ARN (informație) codificată de gena, o copie a care caută să elimine. La transcriptazei inverse evaluate-ARNm sintetizează catena ADN complementar, și apoi să-l prin intermediul a doua catenă de ADN aceeași enzimă sintetizată. Rezultatul este o structură de genă este aceeași ca și cea care a fost sintetizat ARNm.

În acest mod, în laboratoarele din multe țări, o întreagă serie de gene. În țara noastră, conducerea iodului V. A. Engelgardta a fost elaborat „revers transcriptaza“ - un program de sinteză a genei prin utilizarea acestei enzime. Implementarea proiectului au participat principalele instituții naționale și internaționale. Drept urmare, 1974-1978 a fost sintetizat g. Globinei gene porumbel, iepure și uman, precum și gene de șobolan mitocondrii ficat, partea a genei care codifică proteinele imune de șoarece, și altele.

Genele sintetizate prin revers transcriere-PS, nu sunt regiuni de reglementare HN inactive funcțional. Prin urmare, transcrierea de copii de ADN, se recomandă să pro-ARNm, care au toate copiile necesare ale părților de reglementare ale genei.

Alte metode descrise gene pot fi obținute prin vyde-ment folosind fagi transducing. În acest fel, în 1969, a fost izolat pentru prima genă lactozei de E. coli. Cu toate acestea, această metodă de obținere a genelor nu este întotdeauna adecvat, deoarece permite spațiu strict de localizare fagi. Prin urmare, utilizarea altor metode de izolare a fragmentelor de ADN cu gene necesare pentru transfer.

endonuclează de restricție (enzimă de restricție). Thieme-o portanta im- pentru dezvoltarea ingineriei genetice a fost descoperirea enzimelor în celulele bacteriilor capabile tăierea unei molecule de ADN în funcțiune primele locații specifice. Aceste enzime sunt numite restricție endonucleaze fragment-AL sau enzime de restricție, iar procesul de „tăiere TION“ a moleculei de ADN numită o digestie de restricție. Cu enzimele de restricție legate progrese în biologia moleculară. Ei au devenit unul dintre elementele-cheie ale ingineriei genetice. segment ADN recunoscut enzimă restricție particulară, cuprinde grafic spe-secvență de perechi aproximativ opt baze palindrom este Xia. Palindrome este o secvență de ADN care este citită identic în ambele sensuri de la Z'-terminal al fiecărui lanț. De exemplu, E. coli numit cu enzimă de restricție EcoRI recunoaște secvența

și atașarea la acesta, ceea ce face o crestătură o singură bandă pe ambele părți, adică. e. se taie în secțiuni simetrice indicate de săgeți. Rezultată molecula de ADN dublu catenar, în cazul în care inelul avea, capătă structură liniară din cauza ruperii. La marginile moleculei formează un capete adezive prevăzute porțiuni monocatenare a patru nukleoti-ing: la un capăt este o secvență Aatt la Drew-d - TTAA. În prezența capetelor adezive ale moleculei de ADN linear este capabilă să re-formă într-un inel-up, fără tratament suplimentar. enzime de restricție au fost descoperite, know-ing o largă varietate de secvențe de nucleotide. On-exemplu, enzima de restricție recunoaște o secvență EcoRI TSTSTGG.

În prezent, există peste 200 de enzime de restricție cunoscute, caracterizate Terni pentru diferite tipuri de microorganisme. Acest lucru deschide noi oportunități pentru experimentatori. Moleculele imens inaltime Shih-organisme includ un număr mare de tăiere situsuri pentru enzime de restricție. In tratamentul ADN cu enzime de restricție Obra formă un multiplu fragmente de ADN în care reprezentările individuale gene HN. Apoi, genele pot fi conectate într-o anumită structură. Lacunele rămase într-o astfel de structură, reuni ADN-ul toroanele ligază. Există o altă metodă de obținere a fragmentelor de ADN cu capete adezive. Se constă în aceea că porțiunile izolate sau sintetizate artificial ale ADN-ops endonucleazică scurtarea regiunilor ADN la ambele capete, și apoi folosind un sferazy-enzimă polinukleotidtran parcată la această secvență se termină și nucleotide lauril-adenil timidilic. Lungimea lipicios poli-A și poli-T este de 50-100 nucleotide. Când inserat gena într-un vector utilizează atât metoda și examinate adesea împreună.

DNA Rekbmbinantnye. ADN-ul recombinant este un artificia-venno rezultând molecula de ADN. Are forma unui inel, include o genă (gene), care constituie genetic-obiect lyatsy manipulările și așa-numitul vector oferind sinteza reproducerii și ADN-ului recombinant într-o celulă gazdă a unui anumit produs codificat de gena modificată. Vectorii includ acele componente ale ADN-ului recombinant care sunt capabile de gene străine acceptele-ment și să asigure replicarea acestora în celulele gazdă. Vectorii trebuie să aibă următoarele caracteristici: 1) au proprietăți replicon; 2) transporta situsurile de substrat pentru enzime de restricție sau ADN Retehnologizarea imposibilă; 3) cuprind una sau mai multe gene marker pentru fenotip ar putea determina dacă transmisia acestuia. Studiile au arătat că vectori eficiente sunt plasmide. Dintre acești vectori sunt utilizați ca Col El, pSC 101 și altele. Dintre virusurile ca vectori folosind fagul A. SV 40 și derivați ai acestora. Vekto-ry conferi capacitatea de recombinare molecula ditsya-Play, indiferent de cromozomul celulei bacteriene.

Un compus al vectorului cu fragmentul de ADN poate fi realizată în următoarele moduri: prin utilizarea capetelor coezive generate în ADN prin acțiunea endonucleazelor de restricție; teza Syn de fragmente polinucleotidice suplimentare din fiecare catenă de ADN (poli-A și poli-T); capete boante conexiune utilizând ligază T4.

Figura 25 prezintă gena sinteza enzimatică și inserarea acestuia într-o plasmidă vector. Lăsat mARN folosind transcriptaza sintetizat catena ADN revers (ADNc), mARN este apoi îndepărtată printr-o polimerază ADN-alcalin și prin faptul că a terminat al doilea catenă de ADNc, exonuclează UCO-rachivayut ambele catene ale ADN-ului și transferază terminală suturate la capetele poli secvenței T. Aceeași cifră

Fig. sinteza 25. enzimatica a genei N-l încorporarea în plasmida vector

(Prin SM Gershevdonu)

dreapta arată că plasmida vector ADN timp Rezai enzima de restricție circulară și este transformată într-o formă liniară, iar apoi a exonucleazei este scurtat cu lanț și transferază terminală la Shiva la acesta poliA secvență. În ultima etapă este conectat ambele tipuri de molecule de ADN pentru a da un kula-hibrid mole - plasmidă vector cu integrat genomului NYM sintetizat în aceasta. Rupturile spiralele ADN reunesc ligazei.

În acest caz, este cunoscut, care gena inclusă în plasmida-ing vector. Dar, în lucrările pentru transgenică mai susceptibile de a avea de a face cu mai multe fragmente de ADN, iar printre ele includ doar singure gene, care urmează să fie transferat. Pentru fragmente de ADN cu o genă particulară utilizată așa-numita metodă pușcă, care constă în aceea că un mecanic sau enzime ADN este împărțit în mai multe fragmente mici, după care au fost hibridizate orbește la molecule de ADN vector. Inainte de acest vector ADN a fost tratat restrik-tazoy pentru a conferi o formă liniară și formarea capetelor lipicioase. După introducerea moleculelor recombinante în E. coli folosind medii selective secreta acele bacterii în care fragmentul ADN a fost gena. produsul genei inclus este detectată prin acțiunea sa sub formă de substanță certă (o enzimă, un hormon, și așa mai departe. D.). Reproducerea în bacterii

identic numit clonarea ADN-ului recombinant. Fiecare clonă conține un ADN recombinant bacterii. Metodele dezvoltate pentru a produce substituții de nucleotide în ADN-ul genei clonate și modifica astfel proprietățile proteinei codificată de această genă.

Introducerea într-o celulă a moleculelor recombinante și sinteza proteinei chuzheroden-Nogo. Cel mai adesea molecule recombinante sunt introduse în celule bacteriene prin transformare. Primele celule bacto ry, în scopul de a spori capacitatea acestora de a absorbi ADN-ul plasmidic a fost tratat cu clorură de calciu sau clorură de bariu. După aceea, soluția de suspensie de celule a fost injectat cu molecule E recombinante. Unele dintre aceste molecule pentru a pătrunde în interiorul celulelor, iar o parte din ele să se atașeze la membranele celulare încep să prolifereze și funcția (Fig. 26).

Fig. 26. O experiență tipică ingineriei genetice (pentru Beckingeham-Smith, 1975)

Fig. 27. Funcționarea genei sintetizate chimic somatostatin uman în celule de E. coli (nr K. Itakura și colab.)

Una dintre cele mai importante zone pentru practicarea ingineriei genetice - microorganisme de proiectare care produc substanțe utile. Primul în această direcție au fost studii TION K. Itakura și H. Boeyra și colab. (1977). Ei au fost în stare să finalizeze expresia Xia a unei gene care codifică hormonul somatostatin în celule de E. coli (Fig. 27). Apoi, în diferite țări, celule de E. coli au fost utilizate pentru sinteza unui număr de proteine ​​și hormoni umane și animale: insulină, interferoni, hormyl asupra creșterii, urokinaza, calcitonina, albumină, timosin, etc. In laboratoarele A. A. Baeva, Yu A. Ovchinnikova.. MN Kolosova, E. D. Sverdlova și colab., realizat expresia genelor, codificării de fierbere-encefalină, interferon leucocitar, bradichinină, somn totropin et al.

În ultimii ani, acordă o mare atenție la crearea de vaccinuri inginerie genetica. Antigeni obținute din microorganisme recombinante sau culturi de celule în care gena a introdus patogen lenny-definite. materi- obținut această metodă. Al pentru vaccinarea împotriva hepatitei B, gripa, malaria, febra aftoasă, rabie, porci paravirusa și alții. În țara noastră, a făcut transcrierea inversă a ARN HCV A. ADN care codifică o proteină virală a hepatitei B au fost cusute

ADN-ul virusului variolei. Ca urmare a unei culturi variola slăbit se leagă te-imunitate impotriva unei boli periculoase - hepatită. Vaccinul trece productia de test.

Tulpinile de bacterii care produc substanțe active cu op-organisme la oameni și animale pot fi utilizate pentru producția industrială de medicamente.

În țara noastră, lucrează la tehnicile de preparare a genelor clorhidric superproducers inginerie produse caracteristice celulelor, cum ar fi aminoacizi, vitamine, enzime, și pentru a crea culturi se degradează în mod activ de petrol, masa plastică epuizeze naftalină fixează azotul și m. d.